Learning the structural diversity in random protein sequence space

Motivation

• Known: 단백질 서열 공간은 천문학적으로 크며, 현존 단백질 설계는 진화적 탐색으로 얻은 제한된 서열에 의존한다. 무작위 라이브러리는 소수 기능적 단백질을 생성했지만 구조 다양성을 체계적으로 매핑하지는 못했다.
• Gap: 무작위 서열 공간의 구조 다양성을 고해상도로 체계적으로 규명하고, 그 학습 가능성과 자연 단백질에 대한 일반화 능력을 입증하는 대규모 실험적 증거가 부족했다.
• Why: 단백질 진화의 기본 원리를 이해하고 신규 단백질 설계를 위한 설계 원리의 일반성을 확장하기 위해, 무작위 서열에서 접근 가능한 구조들의 빈도와 특성을 규명하는 것이 중요하다.
• Approach: CoLiDe 알고리즘으로 설계한 20F109 라이브러리(10^9 무작위 위치)를 구성하고, 유전자 암호화 FRET 쌍을 융합한 고처리량 in vivo 바이오센서로 구조 상태(비정렬·응집·컴팩트)를 분류한 후, NGS 시퀀싱으로 서열 특성을 추출하여 머신러닝 분류기를 훈련하고 검증했다.

Achievement

Figure 2. Predicted properties and experimental solubility assessment of FRET-FACS selected

• 100만 개 합성 단백질 스크리닝: FRET 기반 proximity biosensor로 무작위 서열의 구조 다양성을 해상도 높게 매핑
• 구조적 이질성 규명: 비정렬 사슬, 응집체, 구상 단백질 유사 컴팩트 구조의 세 가지 뚜렷한 표현형 식별
• 특성 발굴: 소수성 및 컴팩트성이 FRET 정의 단백질 상태를 주도하며, 고FRET 집단에서 전하된 잔기 농축 발견
• 머신러닝 일반화: ESMFold 예측 구조 특성으로 훈련한 신경망 분류기가 무작위 서열뿐 아니라 자연 단백질까지 FRET 카테고리에 할당 가능
• 진화적 편향 극복: 자연 아미노산 조성을 따르면서도 자연 단백질과 서열 공간의 반대편에 위치한 라이브러리로 새로운 설계 원리 제공

How

Figure 2. Predicted properties and experimental solubility assessment of FRET-FACS selected

• Golden Gate Assembly 기반 PCR 불필요 라이브러리 생성 전략으로 비용 효율적 구성
• in vitro(시간 분해 형광 분광) 및 in vivo(FLIM, flow cytometry) 다층 검증으로 FRET 바이오센서 시스템 확립
• 여러 라운드의 FACS 소팅(L1, L2 저FRET; H1, H2, H3 고FRET)으로 극단값 신호 농축
• 서열-구조 특성 추출(조성, 소수성, 등전점, 복잡도, ESMFold 예측 2차 구조·회전반경·SASA) 및 신경망 분류기 훈련
• NGS 매핑과 통계 분석으로 선택 라운드 간 풍요 변화 정량화

Originality

• 대규모 체계적 매핑: 기존 무작위 라이브러리 연구(수천 개)보다 100배 이상 큰 규모(백만 개)로 무작위 서열 공간의 구조 다양성을 초래
• 고해상도 구조 표현형 분류: FRET 기반 proximity biosensor로 개별 단백질의 집단내 응집 상태 구분(저밀도 vs 고밀도 응집체) — 기존 단순 용해도 분석 보다 정교함
• 자연 단백질 일반화 증명: 무작위 서열로만 훈련한 머신러닝이 자연 프로테옴 분류 가능함을 보인 최초 증거
• 설계 원리의 진화적 제약 극복: 무작위 공간 탐색으로 진화 편향 없는 보편적 구조 설계 원리 제시

Limitation & Further Study

• 샘플 복잡성: 1백만 개 서열 중 약 1/4만 회수되었으며, 다양성이 후기 라운드에서 급격히 감소하여 일부 표현형의 통계적 깊이 제한 가능
• 구조 해석의 간접성: FRET 신호는 집단내 거리를 보고하지만, 원자 수준 3D 구조 정보가 부재하여 예측 구조에 ESMFold 신뢰도에 의존
• 자연 단백질 검증의 제한: 자연 프로테옴으로의 일반화를 제시했으나, 실험적 검증(구조 결정, 생화학적 특성화)은 제시되지 않음
• 세포 환경 특이성: E. coli 발현과 in vivo FRET은 특정 세포 환경에 종속적이므로 다른 숙주나 in vitro 조건에서의 보편성 확인 필요
• 후속 연구: 신규 구조의 기능성, 자연 단백질과의 구조 유사성, 대규모 구조 검증의 확충 필요

Evaluation

총평: 본 연구는 무작위 단백질 서열 공간의 구조 다양성을 최초로 대규모·체계적으로 규명하고, 머신러닝을 통해 자연 단백질로의 일반화 가능성을 입증한 획기적 성과이다. 실험 설계의 엄밀성(다층 검증, NGS 정량화), 데이터의 규모(100만), 개념의 중요성(진화적 제약 초월), 생성적 단백질 설계 분야에 미칠 파급효과 등 모든 면에서 최상위 수준의 기여를 한다.