Agent-Guided De Novo Design of Nanobody Binders Against a Novel Cancer Target

Motivation

• Known: 기존 항체 발굴 방법(동물 면역화, phage display, 합성 라이브러리 스크리닝)은 성공 사례가 있지만 epitope 선택과 서열/파라토프 구조에 대한 통제력이 제한적이며 수개월의 반복 최적화가 필요하다. AlphaFold, Boltz, Chai, RFdiffusion, IgGM, mBER, ESM2 등 ML 기반 구조예측 및 de novo 설계 도구들이 개발되어 명시적 epitope 통제가 가능한 단백질 결합체 설계를 가능케 했다.
• Gap: 다양한 ML 모델을 통합된 발굴 파이프라인으로 결합하는 것은 여전히 병목이며, 보고된 실험적 hit rate는 0.1%~39%로 편차가 크다. 특히 실험적으로 해석된 구조가 없고 사전 항체 정보가 전혀 없는 진정한 novel target(다중 도메인 구조, 유연한 도메인 간 영역, 잠재적 glycosylation 부위 보유)에 대한 검증은 최근에야 등장하기 시작했다.
• Why: 실험적 구조나 선행 항체 정보 없이도 컴퓨터적으로 예측된 구조만으로 novel target에 대해 고친화도 nanobody를 설계할 수 있음을 입증한다면, 치료용 항체 발굴의 속도와 범위를 근본적으로 확장하고 기존에 다루기 어려웠던 cryptic epitope 및 미지 표적에 대한 신약 개발 가능성을 열 수 있다.
• Approach: hotspot recommendation agent로 epitope을 식별하고, 세 가지 독립적 de novo 설계 방법(RFantibody, IgGM, mBER)과 다중 예측 항원 구조를 결합해 대규모 후보군을 생성한 뒤, 구조/서열 기반 다중 지표 스코어링과 Pareto 기반 후보 선택 에이전트로 필터링하고, yeast surface display 및 SPR로 실험 검증하는 통합 workflow를 제시한다.

Achievement

Figure 2. Binding affinity landscape and predicted structures of top de novo designed VHH antibodies. (a) Equilibrium di

1. 대규모 de novo 설계 및 스크리닝 파이프라인 구축: 8개 epitope 영역과 3개 VHH framework에 걸쳐 288,000개의 nanobody 후보를 설계하고, Pareto 기반 필터링으로 100,000개를 선별했다.
2. 실험적 결합체 검증 성공: yeast display 및 2회 FACS enrichment를 거쳐 116개 후보를 SPR로 특성화했으며, 이 중 46개(39.7%)가 신뢰할 수 있는 kinetic fit(Rmax≥30 RU)을 보였고 KD는 0.66 nM~305 nM(중간값 31.7 nM)이었다.
3. 최고 성능 결합체 도출: 최상위 후보 PRJ266_044는 KD=0.66 nM을 달성했으며, sub-nanomolar 범위의 추가 후보(PRJ266_104, KD=0.13 nM)도 확인했다.
4. 설계 파라미터 영향 분석: framework, 설계 방법(RFantibody/IgGM/mBER), 구조예측 방법, hotspot 그룹별 결합 친화도 분포를 비교 분석하여 framework가 강한 결합체 산출 여부를 좌우하는 핵심 요인임을 규명했다.
5. 비특이적 결합 부재 확인: 116개 후보 전부에서 무관 항원(TfR1)에 대한 결합이 없음을 확인해 표적 특이성을 입증했다.

How

Figure 1. Integrated computational and experimental pipeline for de novo nanobody design. The workflow proceeds through

• 실험적으로 해석된 구조가 없는 표적에 대해 4가지 folding 방법으로 항원 구조를 예측하고 TM-score로 구조적 일치성을 검증함
• 내부 개발한 hotspot recommendation agent를 통해 8개의 결합 epitope을 추천
• RFantibody, mBER, IgGM 세 가지 상호보완적 방법과 여러 epitope·framework 조합으로 288,000개 후보 생성
• NanobodyBuilder2 pLDDT, Boltz-2 복합체 품질, CDR-항원 거리 등 구조 기반 지표와 MochiBind 같은 서열 기반 결합 친화도 예측 및 항체 서열 liability 검사를 포함한 다중 지표 스코어링 수행
• Candidate Selection Agent가 다중 목적 최적화를 통해 100,000개 최종 후보 선정
• yeast surface display(발현율 90.6%)와 2회의 FACS enrichment로 항원 특이적 결합체 식별, MFI 기준으로 116개 후보를 SPR 특성화 단계로 진출시킴
• SPR을 통해 KD와 Rmax를 측정하고, Kruskal-Wallis 검정 등 통계 분석으로 framework, 설계 방법, 구조예측 방법, hotspot 그룹 간 차이를 비교
• Boltz-2 co-folding으로 설계된 서열의 접촉 부위가 agent가 추천한 hotspot 근처에 집중되는지 독립적으로 검증

Originality

• 실험적 구조나 사전 항체 정보가 전무한 진정한 novel target에 대해 완전히 de novo로 nanobody 결합체를 설계하고 실험적으로 검증한 드문 사례
• 단일 설계 방법이 아닌 세 가지 독립적 de novo 생성 방법(RFantibody, IgGM, mBER)을 병렬적으로 활용하고 그 성능을 직접 비교한 점
• hotspot recommendation agent와 candidate selection agent라는 자동화된 의사결정 에이전트를 파이프라인 전 과정에 통합해 대규모(288,000개) 후보군을 효율적으로 처리한 agent-guided 접근
• 구조 기반 지표와 서열 기반 결합 친화도 예측 모델(MochiBind)을 결합한 multi-metric Pareto 스코어링 전략

Limitation & Further Study

• SPR은 표적 결합을 확인하지만 실제 epitope을 규명하지는 못하며, 설계 시 조건화한 hotspot과 실제 결합 부위 간 매핑이 엄밀히 일대일이 아니어서 추가적인 실험적 epitope mapping이 필요함
• Rmax<30 RU인 29개 후보의 KD 값은 잠정적 추정치로, 낮은 활성 농도나 부분적 면역반응성 등으로 인한 신뢰도 저하 문제가 있어 orthogonal 검증이 요구됨
• 3개 framework 중 2개만 고신호 결합체를 산출했고 결과가 Framework B에 강하게 편중되어 있어, framework 선택이 성공률을 좌우하는 요인으로 작용하지만 그 기전은 충분히 규명되지 않음
• hotspot 그룹, 구조예측 방법 간 통계적으로 유의한 차이가 없었으나 그룹별 표본 크기가 작아 통계적 검정력이 제한적임
• 이번 결과는 단일 설계-검증 cycle(첫 DBTL cycle)의 결과이며, 반복적인 최적화(affinity maturation) 및 추가 cycle을 통한 개선 여지가 남아 있음
• 표적 특이적 결합 확인은 이루어졌으나 실제 치료 후보로서의 developability(면역원성, 안정성 등)에 대한 심층 검증은 이후 과제로 남음

Evaluation

총평: 실험적 구조나 사전 항체 정보 없이 진정한 novel target에 대해 agent-guided computational workflow로 nanomolar~sub-nanomolar 결합체를 성공적으로 설계·검증한 실용적이고 의미 있는 성과이며, 향후 반복적 DBTL cycle과 epitope mapping 등 추가 검증을 통해 완성도를 높일 여지가 있다.