Small-molecule binding and sensing with a designed protein family

Motivation

Known: 자연 단백질의 발견과 엔지니어링에 의존한 저분자 결합 단백질 설계가 주로 이루어져 왔으며, 물리 기반 방법과 de novo 설계가 일부 성공했다. 하지만 특권 폴드를 광범위하게 다양화하여 저분자 결합과 센싱으로 변환하는 방법은 제한적이다.
Gap: NTF2 폴드의 설계 가능성을 활용하되, 극성 인터페이스 설계의 어려움과 다양한 저분자를 수용할 수 있는 포켓 기하학의 다양화를 동시에 달성하는 통합적 접근법이 부재했다.
Why: 저분자 바인더와 센서의 de novo 설계는 분석, 환경, 바이오의료 응용 분야에서 필요에 따라 센서를 개발할 수 있는 강력한 도구가 될 수 있어 실용적 가치가 높다.
Approach: Deep learning 기반 구조 생성(hallucination)과 LigandMPNN을 활용한 시퀀스 설계로 다양한 NTF2 스캐폴드를 생성하고, RIFdock으로 저분자를 도킹하며, AlphaFold와 Rosetta로 설계를 검증하여 실험적으로 구현했다.

Fig. 2 | Characterization of small-molecule–binding proteins. A Chemical

10,000개 이상의 diverse NTF2 스캐폴드 생성: Deep learning 기반 hallucination과 parametric 생성으로 다양한 포켓 기하학을 갖는 NTF2 폴드 패밀리 설계
6개 저분자 표적에 대한 바인더 성공적 설계: Cortisol, warfarin, rocuronium, apixaban, SN-38, 17-α-hydroxyprogesterone에 대해 nanomolar에서 low micromolar 결합 친화력 달성
원자 수준의 설계 정확도 검증: 생물물리적 특성화와 구조 분석으로 computational 설계의 높은 정확도 확인
CID 기반 cortisol 바이오센서 시연: Designed cortisol binder를 이용하여 chemically induced dimerization 시스템 구축 및 센싱 기능 입증

Fig. 1 | NTF2 based design strategy for binding and sensing small molecules.

NTF2 fold family 생성: Hallucination (Set 1), ProteinMPNN + AlphaFold 검증 (Set 2), Rosetta parametric 생성 + AlphaFold 검증 (Set 3)으로 총 10,000+ 스캐폴드 확보
저분자 도킹 및 설계: RIFdock을 사용하여 6개 저분자를 스캐폴드 포켓에 배치
극성 인터페이스 설계: 방법 1 (HBNet 기반 사전 설치), 방법 2 (LigandMPNN 활용)로 단백질-저분자 극성 상호작용 최적화
설계 선별: Rosetta로 수소결합 수, 결합 에너지(ddG), contact molecular surface(CMS) 계산 및 AlphaFold로 fold 재구성 검증
Yeast surface display 스크리닝: Synthetic oligonucleotides로 제조된 설계를 yeast에 발현시켜 바인더 스크리닝 수행
구조적 특성화: X-ray 결정학과 생물물리적 방법으로 설계된 바인더의 구조와 친화력 검증

Deep learning과 physics-based 방법의 통합: Hallucination, ProteinMPNN, LigandMPNN, AlphaFold, RIFdock, Rosetta를 조합하여 체계적인 설계 파이프라인 구축
NTF2 폴드의 체계적 다양화: 단순히 natural diversity를 모방하는 대신, minimal loops를 유지하면서 diverse pocket geometries를 설계 가능하도록 구조적으로 최적화
LigandMPNN의 활용: 단백질-단백질 상호작용과 단백질-저분자 상호작용을 동시에 고려하는 deep learning 모델로 극성 인터페이스 설계의 난제 해결
CID 기반 센싱 플랫폼: 설계된 저분자 바인더를 chemically induced dimerization 시스템으로 변환하여 바이오센서 구현의 새로운 경로 제시
대규모 계산-실험 검증: 54,764개의 설계 후보에서 성공적인 바인더 도출, high-throughput screening과 구조적 검증으로 설계 정확도 입증

설계 성공률 명시 필요: 전체 설계 후보 대비 최종 성공한 바인더의 비율이 상대적으로 낮으며, 어떤 설계 특성이 성공을 결정하는지 체계적 분석 부족
극성 기능기 처리의 제한: 극성 인터페이스 설계가 여전히 도전적이며, 복잡한 극성 패턴을 갖는 저분자에 대한 설계 일반화 가능성 미확인
센싱 플랫폼의 동적 범위와 특이성: Cortisol 센서의 in vivo 성능, 생리적 농도 범위에서의 동적 범위, 구조적 유사 물질에 대한 교차 반응성이 상세히 평가되지 않음
확장성 및 다른 스캐폴드 적용: NTF2 폴드 특화 설계이므로 다른 단백질 폴드에 대한 일반화 가능성 미검증, 더 큰 또는 극성이 높은 저분자로의 확장 가능성 불명확
후속 연구: (1) 설계 성공 인자의 머신러닝 기반 예측 모델 개발, (2) 다양한 폴드와 저분자에 대한 접근법 확대, (3) In vivo 센싱 및 치료 응용 개발, (4) 더 높은 친화력과 특이성을 위한 directed evolution 결합